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引言

在传统的小农耕作系统中，人们越来越关注将根瘤菌用作生物肥料，这促使人们鉴定了大量热带根瘤菌菌株，并开展了对其多样性的研究。

在本实验中，我们对根瘤菌分离株进行了菌落形态、生长和生化特征的表型表征,通过对16S rRNA基因使用Msp I、EcoR I和Hae进行的PCR扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA），我们确定了不同地区的根瘤菌多样性限制酶。

本地根瘤菌分离株在形态上多种多样，共分为九种不同的形态类型，与此相应，基于16S rRNA基因的限制性酶切分析表明，在根瘤菌种群中有四种显著（p < 0.05）的遗传变异分布，占总比例的97.5%，而不同根瘤菌种群之间的遗传变异仅占总比例的1.5%。

本地根瘤菌表现出高度的形态和基因型多样性，表明该地区可能存在新的根瘤菌菌株，值得进一步研究以获取对普通假单胞菌生物固氮有效的菌株。

我们计划对这些分离物进行基因序列分析并测试其共生特性，以确定它们在不同环境中的特性和功能。

一、根瘤菌在农业生态系统中的环保、高效、可持续应用

根瘤菌在农业生态系统中发挥重要作用，与豆科植物形成共生关系，实现生物固氮，一些根瘤菌菌株可增强植物激素产生、矿物质吸收，并减少金属对污染土壤中植物的毒性。

根瘤菌生物肥料的使用增加，带来显著的农艺效益（如增产、节约成本和改善土壤健康），这其中本地根瘤菌分离株的分布和遗传变异数据有助于选择开发用作豆类生物肥料的新根瘤菌菌株。

根瘤菌-豆科植物共生是宿主特异性关联，需要确定与特定豆科植物相关的根瘤菌菌株和多样性，以更好地利用根瘤菌生物肥料的益处。

根瘤菌的分布和多样性受地理位置影响，通过确定它们的系统发育可以揭示它们的进化起源。

分类学上，根瘤菌有不同的异质类群，包括构成大多数根瘤菌物种的α类群和与含羞草属相互作用的β类群。

目前已鉴定出大约40种属于7个α-变形菌属的根瘤菌，包括根瘤菌、中华根瘤菌、固氮菌、缓生根瘤菌、异生根瘤菌、中生根瘤菌、缓生根瘤菌和甲基杆菌，最近还发现了来自β和γ变形菌的其他固氮细菌与豆类形成共生关系。

不同属的根瘤菌常常与特定豆科植物结瘤固氮，如根瘤菌菌株主要与普通豆类（Phaseolus vulgaris L.）和鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）共生，而缓生根瘤菌菌株则在大豆（Glycine max L. Merrill）、豇豆（Vigna unguiculata L.）和绿豆（Vigna radiata L.）中更为常见。

两个属的交叉接种，如绿豆（V. radiata L.），这对种植不同类型豆科植物的农民来说具有利益和经济价值。

与其他普通豆类（P. vulgaris L.）一样，MAC豆与根瘤菌建立了互惠共生的伙伴关系，导致根瘤的形成，从而促进大气中的固氮作用。

MAC豆是一种通常生长迅速的根瘤菌，包括热带根瘤菌、等根瘤菌、菜豆根瘤菌、豆科根瘤菌、鸡根瘤菌和苜蓿中华根瘤菌。

MAC豆是通过大力育种生产的，与通常种植的灌木豆相比，其设计具有更高的共生固氮潜力和谷物产量。

对热带地区根瘤菌的分布进行的研究揭示了显著的表型和基因型特征差异，这导致了多个不同群体的鉴定和新菌株的描述。

根据之前的研究，根瘤菌菌株之间存在很大的异质性，因此需要对根瘤菌的分布、多样性和固氮性能进行更多的研究。

尽管农业资源压力和恶劣的气候条件对土壤生态系统及其生物多样性产生不利影响，但在热带土壤中存在着丰富多样的根瘤菌种类。

在这种情况下，应使用有效的根瘤菌分类方法，充分表征不同的根瘤菌基因型，可以开发出更准确、更快速和更有效的分子技术，以帮助传统的表型和形态培养技术区分不同的微生物属、种和菌株。

聚合酶链反应（PCR）、电泳和基因测序工具通过基于不同的遗传性状模式区分一个物种甚至接近菌株水平的成员，彻底改变了微生物的表征。

与其他传统方法相比，PCR、宏基因组学和第三代基因测序方法具有更高的可靠性、更快的速度和更灵敏的方法。

本研究利用PCR和扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）工具来确定在不同AEZ发现的本地根瘤菌的遗传多样性。

ARDRA涉及使用特定限制酶扩增和消化16S rDNA区域。

几种根瘤菌特异性和通用引物已用于扩增和测序，并产生了可区分的根瘤菌系统发育。

普通豆结瘤根瘤菌的16S-23S ITS区域的PCR-RFLP分析中分离的根瘤菌表现出高遗传多样性，包含43个ITS基因型，以64%的相似性分为10个组。

本研究的目的是分离、鉴定形态学和遗传特征，并确定与生长在不同AEZ的MAC 13和MAC 64攀缘豆相关的根瘤菌种群的多样性。

二、从根瘤中分离根瘤菌

本实验在四个不同地点，使用MAC 13和MAC 64攀缘豆作为寄主植物，对根瘤菌进行了田间实验采样。

每个实验区块准备了三个3m × 3m的地块，并以75cm × 30cm间距播种攀缘豆种子。

播种后45天进行田间随机取样，使用无菌干净的铲子从侧面挖掘约15厘米，直到约20厘米的深度，将根瘤从根部剥离，置于无菌铝箔中，并保存在密封瓶中，以防止干燥。

从每个地点选择十个健康和未受损的MAC 13和MAC 64攀缘豆根瘤，并用于根瘤菌的分离。

清洗结瘤，在1%次氯酸钠溶液中表面灭菌3分钟，用七次无菌蒸馏水冲洗，然后用灭菌玻璃棒压碎。

将产生的悬浮液环在添加了刚果红（0.00125 mg/kg）的酵母提取物甘露醇琼脂（YEMA）上划线接种，并在28°C的黑暗中培养3-5天。

通过在YEMA和含有溴百里酚蓝（BTB，0.00125 mg/kg）的YEMA培养皿上重复接种，对出现的根瘤菌典型的单菌落进行传代培养。

实验共获得41株根瘤菌，所有分离株都保存在密封YEMA瓶中，并保存在4°C和含有25%甘油-酵母提取物甘露醇液体培养基（YEMB）的小瓶中，保存温度为-20°C。

使用标准微生物学技术对所有分离株根据选定的形态参数进行表征：菌落大小、形状、边界、高度、颜色、粘性、透明度和产生胞外多糖胶的能力。

进行的其他测试包括革兰氏染色，其中在 YEMA 上培养的年轻纯分离物（3-4 天龄）涂抹在干净的显微镜载玻片上。将湿涂片风干、热固定，然后进行革兰氏染色，并将制备好的载玻片在复式光学显微镜下油浸观察。

在含有溴百里酚蓝 (YEMA-BTB) 的 YEMA 培养基中测定是否生成酸或碱，将板在黑暗中于 28°C 孵育 7 天。

YEMA-BTB 的绿色变为黄色的分离株被鉴定为产酸者和快速生长者，将 YEMA-BTB 培养基变成蓝色的分离物被认为是碱性生产者和缓慢生长者。

根瘤菌分离物在蛋白胨葡萄糖琼脂平板中培养，在 28°C 下避光培养 4 天，根据观察到的形态培养、革兰氏染色和生长特征的差异，将分离株分为不同的形态类型组。

分子研究涉及 41 株根瘤菌分离株，使用三种限制酶Hae III、EcoR I 和Msp I（Biolabs，England），使用 16s rRNA 基因的扩增 rDNA 限制性分析 (ARDRA) 对来自的本地分离株的遗传相关性进行分析。

将根瘤菌培养物在 YEMA 平板中于 28°C 黑暗中生长 3 天，重新悬浮在含有 400 μl 生理盐水的无菌 eppendorf 试管中，涡旋振荡 20 秒，并以 13,000 rpm 的转速离心 10 分钟。

小心倒出上清液，留下细胞沉淀，用生理盐水洗涤五次以去除粘稠的胞外多糖（EPS）后，二次收获细胞沉淀并重新悬浮在 400 μl 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 裂解缓冲液中，涡旋并在 65°C 的水浴中孵育 2 小时。

在孵育期间每 20 分钟间歇性倒置试管，通过加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇溶液（25:24:1）提取 DNA，涡旋并在 4°C 下以 13,000 rpm 离心 10 分钟。

将上清液小心转移到一个新的无菌 1.5 ml eppendorf 试管中，在其中加入等体积（400 μl）的无水乙醇，并在 4°C 下孵育 10 分钟以沉淀。

将沉淀的 DNA 以 13,000 rpm 离心 8 分钟，弃去上清液，将 DNA 沉淀风干 40 分钟并溶解在 40 μl 不含 DNase 的水中并在-20°C冷藏储存。

在 30 μl 反应液中进行PCR 扩增，反应液中含有 23.55 μl 无菌 PCR 水、3.0 μl 缓冲液 、0.6 μl dNTP (10 mM)、0.3 μl Y1 和 Y3 引物 (10 μM)、0.6 μl 5% Tween 20、0.15 μl Taq DNA 聚合酶、和 1.5 μl DNA 模板。

用于 16S rRNA 基因 PCR 扩增的引物序列为：Y1 正向引物（5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3'）对应于位置 20-43 ， Y3 反向引物（5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3'）对应于大肠杆菌16S rDNA 序列的1482–1507，对照组使用不含DNA的引物作为对比。

DNA 在 Techgene 热循环仪 (Techne) 中扩增，程序如下运行；94°C 初始 DNA 变性 2 分钟；35 个循环（94°C 变性 45 秒，62°C 退火 45 秒，72°C 延伸 2 分钟），最终延伸在 72°C 下进行 5 分钟。

扩增的 PCR 产物通过凝胶电泳在 1% 琼脂糖凝胶上显现，使用SYBR-Green 染色。

用1 Kb 的 DNA 阶梯估计电泳条带大小，凝胶在三硼酸盐乙二胺四乙酸 (0.5X TBE) 缓冲液中以 80 V 运行 50 分钟，并使用 UV 透射照明器进行可视化。

使用Hae III、Eco R I 和Msp I 限制酶 (Biolabs) 消化分离株和参考菌株的聚合酶链反应产物。

将包含 3.8 μl PCR 水、1.0 μl 反应缓冲液、0.2 μl 限制酶和 5.0 μl PCR 扩增子的主混合物 (10.0 μl) 在 37°C 下消化 1 小时。

使用 SYBR-Green 对限制性消化物（片段）进行染色，并在 2% 琼脂糖凝胶上进行分离，并使用 100 bp DNA 阶梯来估计片段大小。

凝胶在 80 V 下运行 50 分钟，并使用 UV 透射照明器进行可视化，实验过程中，我们观察到不同的条带模式，并对相似模式的频率进行评分。

基于 PCR 限制后形成的不同条带模式的根瘤菌遗传多样性数据以二进制形式编码，并进行分析。

三、分离株的形态培养特征

从使用 MAC 13 和 MAC 64 攀缘豆的田间实验采样实验中，获得了 41 个纯根瘤菌分离株，根据它们的形态文化和生化特征将其分为九个不同的形态型组。

形态类型 III 是最丰富的 (29%)，形态类型 II 占分离株总数的 2%，所有分离株均为革兰氏阴性杆菌，在 YEMA-CR 培养基上避光孵育时不吸收刚果红染料。

当在 YEMA-BTB 上生长时，所有分离株都将 BTB 指示剂从深绿色变为黄色，表明这些分离株是产酸者和快速生长者。

观察到的菌落颜色有乳白色、乳白色、乳黄色和水样菌落，这些菌落不透明或半透明，具有坚硬的胶状或光滑的粘液质地。

由于产生过多的 EPS，大多数分离株具有粘液质地，所有分离株都有完整的菌落边缘，但菌落高度随着在 YEMA 培养基上观察到的凸起和凸起的菌落而变化。

参考菌株Rhizobium tropici CIAT 899 和Rhizobium etli USDA 2667 的形态特征与形态 III 非常相似，而Rhizobium leguminosarum菌株 446 与形态 V 非常相似。

16S rDNA 区域的 PCR 扩增产生了大约 1500 bp 的单个条带。

使用酶EcoR I、Hae III和Msp I限制攀缘豆根瘤菌分离株的 16S rRNA 扩增子产生多条带模式。

限制酶Msp I 产生了最多样化的多态性模式。

基于 16S rRNA 扩增子的 ARDRA 分析，与其他种群相比，来自 ELM 的根瘤菌种群具有最高的平均不同等位基因数 ( Na = 1.92 ± 0.08) 和有效等位基因 ( Ne = 1.55 ± 0.10)。

来自 ELM 的根瘤菌分离株具有最高百分比的多态位点 (92.31% P)，而来自 EUM 和 TLM 的分离株最低，为 61.54% P。

平均 Shannon-Wiener 多样性 ( H ) 估计表明来自的四个根瘤菌种群在遗传上是与来自 ELM 的根瘤菌种群不同，具有最高的遗传多样性估计值H = 0.47。

来自 TLM 区的根瘤菌种群记录了H = 0.31的最低遗传多样性估计值。

四个种群的平均预期杂合度 (He) 不同，范围从 TLM 根瘤菌种群的 0.21 到 ELM 种群的 0.32。

四个根瘤菌种群的分子变异 (AMOVA) 分析表明，种群内（试验农业生态区内）的遗传变异非常高（P = 0.0406；97%），而来自四个 AEZ (2.5%) 的根瘤菌种群之间的差异并不显著。

来自四个区域的 41 个本地分离株和三个根瘤菌参考菌株的主坐标分析 (PCA) 显示出相当大的差异。来自 TUM 区的分离株分布最多，出现在所有四个象限中，而来自 ELM 区的分离株分布最少。

基于 Nei 无偏遗传距离和欧几里德相似性指数的成对种群矩阵，将来自的树状图聚类根瘤菌种群的邻域连接成两个主要类群。

来自 ELM 和 TUM 的根瘤菌种群以 85% 的引导值聚集在一起，而来自 EUM 和 TLM 的根瘤菌种群以 82% 的引导值聚集在一起。

基于扩增 rDNA 限制性分析后的遗传距离和欧几里德相似性指数，系统发育树将天然根瘤菌分离株聚类为三个主要簇 I、II 和 III。

集群 I 由大多数分离株组成，而集群 III 只有一个分离株 ELM5。位于簇 I 中的参考菌株热带根瘤菌CIAT 899 与天然根瘤菌分离株 ELM33 和 TLM32 聚集在一起，表明它们具有密切的遗传关系。

原生分离株 TUM26、TLM28 和 EUM23 聚集在一起，尽管它们来自的不同 AEZ，天然分离物 EUM7 在簇 II 中与豆科根瘤菌菌株 446 紧密聚集，但在一个单独的子分支中。

三、天然根瘤菌分离株的形态特征

革兰氏染色结果和在 YEMA-CR 和 YEMA-BTB 培养基上的生长，初步证实了P. vulgaris L. 结瘤的根瘤菌物种的标准形态培养特征。

它们在 3-5 天内迅速生长， YEMA-BTB 上的颜色从深绿色变为黄色表明所有分离株都是快速生长的并且可能属于根瘤菌属。

温度、金属毒性、pH 和土壤盐度的变化是限制豆科植物-根瘤菌共生共生固氮的主要因素，因此只有那些能够耐受极端条件的菌株才能存活。

本研究中大多数分离株产生的胞外多糖 (EPS) 表明它们具有承受高温、金属毒性、低土壤 pH 值和盐度引起的生理压力的多功能性。

由于降水过多和土壤侵蚀，实验区块周围 AEZ 的土壤呈弱酸性，本地的根瘤菌菌株有望具有生存适应性，以应对恶劣的土壤和环境条件。

使用限制性内切酶EcoR I、Hae III 和Msp I 进行的限制性消化显示出高度多态性和不同的 DNA 片段模式，表明本地根瘤菌分离株存在差异。

平均 Shannon-Wiener 多样性 ( H) 基于 ARDRA 模式分析的遗传距离对根瘤菌种群的估计表明，这些分离株具有遗传多样性，与 TLM 区相比，ELM 区的根瘤菌种群具有最高的遗传多样性估计，后者记录的多样性最低。

根瘤菌多样性的这种变化可能是由研究的四个地点的农业气候和土壤条件的差异引起的，这些结果强化了P. vulgaris L. 与不同根瘤菌菌株结瘤的混杂性质。

较窄的遗传距离也可能是由于 16S rRNA 基因的保守性，它不能区分密切相关的根瘤菌物种。

水平基因转移和基因重组可能导致根瘤菌的遗传变异有限，基于扩增的 16S rDNA 限制谱的分子变异 (AMOVA) 分析显示，本地根瘤菌分离株在根瘤菌种群中存在高度显著的遗传变异，而在四个种群之间均没有。

根据 ARDRA 指纹图谱，MAC 豆根瘤菌的低水平遗传分化可能表明该地区的根瘤菌种群结构较弱，这可能是由不存在限制基因流动的物理障碍导致的。

基于使用 Neighbor-Joining 方法推断的 41 个分离株的进化关系，一些本地分离株与本研究中使用的三个参考根瘤菌菌株紧密聚类。

系统发育树显示了本地根瘤菌分离株之间的多样化遗传变异，这可以从不同的簇和亚簇中看出。

结论

在这项研究中，从中海拔攀援豆 (MAC) 的根瘤中获得了 41 株根瘤菌，根据形态培养和生化特征，将这些菌株分为 9 种形态类型，表明根瘤菌与 MAC 豆结瘤的多样性。

从系统发育树来看，大部分本地根瘤菌与热带根瘤菌CIAT 899 和R. etli USDA 2667 聚集在簇 I 中，本地分离株 TLM 27 和 TUM 41 与R. etli USDA 2667 聚集在一起，而分离株 TLM 32与热带根瘤菌CIAT 899 聚类。

这些表明一些天然根瘤菌与热带根瘤菌CIAT 899、R. etli USDA 2667 和R. leguminosarum菌株 446 之间存在密切的遗传关系。

根据 ARDRA 分析，尽管来自的不同 AEZ，本地分离株 TUM 26、TLM 28 和 EUM 23 聚集在一起，表明原产于不同 AEZ 的一些根瘤菌分离株之间的遗传距离很近。

基于 PCR-ARDRA 分析后获得的遗传特征的聚类分析显示了较大比例的显著性 ( p< 0.05) 在的四个 AEZ 中，种群内遗传变异分布 (97%) 高于种群间分布 (2.5%)。

尽管根瘤菌种群内部显示出高度多样性，但研究区域根瘤菌种群的 Nei 无偏遗传距离的成对种群矩阵显示范围较窄，这表明内部结构弱的遗传种群和高度保守的根瘤菌遗传结构研究区。

需要使用细菌基因组的全部或部分基因序列进行进一步的分子研究，这种研究更灵敏且具有更高的分辨率，以建立原生根瘤菌分离株在物种和菌株水平上的真正多样性。

参考文献

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